LwCas13a 酶檢測(cè)原理基于其RNA介導(dǎo)的RNA內(nèi)切酶活性及反式切割活性，具體如下：

　　1.靶標(biāo)RNA識(shí)別與結(jié)合：該酶在單鏈向?qū)NA（crRNA）的引導(dǎo)下，通過crRNA與靶標(biāo)RNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)，特異性識(shí)別并結(jié)合靶標(biāo)RNA。這一過程依賴于靶標(biāo)RNA中是否存在PFS（原間隔序列側(cè)翼序列）序列，但LwCas13a對(duì)PFS序列的要求并不嚴(yán)格。

　　2.靶標(biāo)RNA切割：結(jié)合靶標(biāo)RNA后，LwCas13a酶發(fā)揮其RNA內(nèi)切酶活性，在特定位點(diǎn)切割靶標(biāo)RNA，使其降解。

　　3.反式切割活性激活：靶標(biāo)RNA被切割后，LwCas13a酶的反式切割活性被激活。這種活性使得LwCas13a酶能夠非特異性地切割體系中任意序列的單鏈RNA（ssRNA），包括熒光標(biāo)記的報(bào)告RNA。

　　4.熒光信號(hào)產(chǎn)生與檢測(cè)：當(dāng)熒光標(biāo)記的報(bào)告RNA被LwCas13a酶切割時(shí)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可以判斷體系中是否存在靶標(biāo)RNA以及其濃度。

　　LwCas13a 酶檢測(cè)原理的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：

　　1.高靈敏度：LwCas13a酶的反式切割活性使其能夠高效切割體系中任意序列的單鏈RNA，從而放大檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。例如，在不進(jìn)行靶標(biāo)擴(kuò)增的情況下，通過電化學(xué)方法，LwCas13a變體從非活性病毒和未提取的臨床樣本中檢測(cè)到了amol濃度的SARS-CoV-2基因組。

　　2.高特異性：LwCas13a酶通過crRNA與靶標(biāo)RNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別，結(jié)合其反式切割活性，能夠準(zhǔn)確區(qū)分靶標(biāo)RNA與非靶標(biāo)RNA，減少假陽性結(jié)果。

　　3.快速檢測(cè)：LwCas13a 酶檢測(cè)原理結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（如RPA），可在短時(shí)間內(nèi)完成靶標(biāo)RNA的擴(kuò)增與檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)快速診斷。例如，針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的檢測(cè)方法，可在37℃的等溫條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)分析或可視化檢測(cè)，檢測(cè)極限為172copies/μl。

　　4.可視化檢測(cè)：通過將LwCas13a酶的反式切割活性與熒光標(biāo)記或側(cè)向流層析試紙條等技術(shù)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的可視化，便于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。